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1.  目的

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)ws216-2008，規(guī)范本中心登革熱IgM抗體的檢測(cè)。

2.  適用范圍

2.1  適用于血清或血漿中登革熱IgM抗體的檢測(cè)。

3.  職責(zé)

檢測(cè)人員：負(fù)責(zé)按照本檢測(cè)細(xì)則對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作是否規(guī)范以及檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)核。

科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作的監(jiān)督和檢測(cè)結(jié)果的審核。

4.  規(guī)程：親和素-生物素法檢測(cè)登革熱IgM抗體。

4.1  原理：在微孔條上包被生物素化抗原，配以酶標(biāo)記抗人IgM單克隆抗體作為標(biāo)記抗原及TMB顯色劑等其它試劑，采用親和素-生物素法檢測(cè)登革熱IgM抗體。

4.2  試劑

4.2.1  生物素化抗原預(yù)包被板

4.2.2  陰性、陽(yáng)性對(duì)照

4.2.3  酶結(jié)合物

4.2.4  30X濃縮洗滌液。（用蒸餾水1：30稀釋使用）

4.2.5  顯色劑A、B液。

4.2.6  終止液。

4.2.7  封片。

4.3  儀器與設(shè)備

4.3.1  20-200μL可調(diào)移液器。

4.3.2  電熱恒溫水溫箱。

4.3.3  微量振蕩器。

4.3.4  洗板機(jī)、酶標(biāo)儀。

4.4  操作步驟

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)或按以下步驟操作。

4.4.1  將試劑盒平衡至室溫后取出反應(yīng)板拆封。

4.4.2  加樣：將待檢標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：41稀釋?zhuān)?/span>5ul-200ul）,于反應(yīng)板中加稀釋好的待檢標(biāo)本及陰陽(yáng)對(duì)照各100ul/孔，設(shè)空白對(duì)照一孔（不加任何液體），輕輕混勻。37℃溫育30分鐘。

4.4.3  甩去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板3次并拍干。

4.4.4  加酶結(jié)合物：每孔2滴，混勻后置37℃溫育30分鐘。

4.4.5  同4.4.3步驟。

4.4.6  顯色：每孔加顯色劑A、B各一滴，用震蕩器混勻，后置37℃溫育10分鐘

4.4.7  用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。

4.4.8  結(jié)果判斷

4.4.8.1  P/N=標(biāo)本OD值/陰性對(duì)照OD值

4.4.8.2  P/N≥2.1為陽(yáng)性；

 

4.4.8.3  1.5≤P/N<2.1 為可疑標(biāo)本；P/N<1.5為陰性。

4.4.8.4  陰性對(duì)照（NC）小于0.10時(shí)以0.10計(jì)，大于0.1小于0.21時(shí)以實(shí)際OD值計(jì)算；若大于0.21時(shí)，實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)了較大誤差，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

4.4.8.5  陽(yáng)性對(duì)照（PC）值≥0.4，實(shí)驗(yàn)成立，否則需重做。

4.6  注意事項(xiàng)

4.6.1  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及待測(cè)標(biāo)本所需微孔反應(yīng)條應(yīng)置37℃平衡30分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時(shí)封存于冰箱中以備后用。在平衡試劑的同時(shí)，待測(cè)標(biāo)本需置室溫平衡30分鐘后再行測(cè)試。

4.6.2  使用前試劑應(yīng)搖勻，并棄去1～2滴后垂直滴加。

4.6.3  封片不能重復(fù)使用。

4.6.4  結(jié)果判斷須在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)完成。

4.6.5  不同批號(hào)的試劑不可混用。

4.6.6  待測(cè)標(biāo)本不可用NaN₃防腐，如需稀釋標(biāo)本，請(qǐng)用小牛血清稀釋。

4.6.7  洗滌時(shí)每孔均須加滿，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。

4.6.8  避免用溶血、混濁或脂血標(biāo)本。