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哪種方法檢測(cè)瘦肉精較精準(zhǔn)?

發(fā)布時(shí)間:2017-4-17 12:52:57??????瀏覽次數(shù):
瘦肉精檢測(cè)高效液相色譜法(鹽酸克倫特羅檢測(cè)方法)
液相色譜儀

一、如何檢測(cè)瘦肉精?

    目前,檢測(cè)瘦肉精的方法主要有四種,即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE)和免疫分析技術(shù)(IA)。而我國(guó)結(jié)合自己的實(shí)際情況,2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種:即高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)。其中將HPLC法作為檢測(cè)瘦肉精的半確證性方法,其最低檢測(cè)限為0.05μg/ kg,優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高,而且假陽(yáng)性率低;缺點(diǎn)是檢測(cè)過(guò)程煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),需貴重儀器、難于操作、價(jià)格昂貴。而GC-MS法優(yōu)點(diǎn)是能在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析。GC-MS法與HPLC法相比,檢測(cè)靈敏度更高,假陽(yáng)性率更低,已將GC-MS法定為檢測(cè)瘦肉精的確證性方法。GC-MS法的缺點(diǎn)同HPLC相似。

    目前,英國(guó)的Randox Laboratories litd和德國(guó)的R-biopharm公司均開(kāi)發(fā)出了檢測(cè)肉品、飼料中瘦肉精的ELISA試劑盒。

二、瘦肉精檢測(cè)所需試劑和試紙

  (1)試劑和材料  以下所有試劑,除特別注明外,均為分析純?cè)噭?;水為符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。
    ①鹽酸克倫特羅對(duì)照品:含鹽酸克倫特羅不得少于98.5%
    ②鹽酸
    ③無(wú)水甲醇
    ④氫氧化鈉
    ⑤磷酸二氫鉀
    ⑥磷酸
    ⑦鹽酸溶液  取鹽酸4.2ml,加水至1000ml,即得。
    ⑧o.5mol/L磷酸二氫鉀溶液  取磷酸二氫鉀68g,加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3.O,用水稀釋至1000ml,即得。
    ⑨0.05mol幾磷酸二氫鉀溶液  取磷酸二氫鉀6.88,加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3.0,用水稀釋至1000mi,即得。
    a.氫氧化鈉溶液  取氫氧化鈉48,加水使溶解成100mi,即得。
    b.鹽酸克倫特羅對(duì)照品儲(chǔ)備液(1mg/mi)  準(zhǔn)確稱取28.3mg鹽酸克倫特羅對(duì)照晶至25ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至25ml,一20~C以下保存,有效期1年。
    ⑩鹽酸克倫特羅對(duì)照品工作液(10ttg/mi)  取lmg/mi儲(chǔ)備液o.5ml到50mi量瓶中,加水至50mi,2~8~C保存,有效期1個(gè)月。
    ⑾鹽酸克倫特羅對(duì)照溶液(100ng/m1)  取1(ug/m1工作液o.5ml到:50mi量瓶中水至50mi,2~8~C保存,有效期1個(gè)月。
    ⑿鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑盒(2~8~C冰箱中保存)
    ⒀固相萃取柱C,s:100mglml含碳量≥17%

    (2)儀器和設(shè)備

STI500高效液相色譜儀

VI2010智能色譜軟件

UV501可變光紫外檢測(cè)器

安捷倫1100二極管陣列檢測(cè)器

8725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、VI-11手動(dòng)進(jìn)樣閥

VertexC18 4.6*250,5um高性能液相色譜柱
    ①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀
    ②分析天平  精度0.00001g
    ③天平  精度0.01g
    ④冷凍離心機(jī)
    ⑤50mi具塞離心管
    ⑥勻漿機(jī)
    ⑦微型振蕩器
    ⑧回旋振蕩器
    ⑨微量移液器  單道20uL,50ul,100uL;多道50~250uL,
    ⑩干熱濃縮器
    ①空氣壓縮機(jī)

    (3)測(cè)定步驟
    ①試料的制備(尿)
    取供試尿lml,于3000r/min離心l0min,上清液作為供試試料,直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    取空白尿lml,于3000r/min離心l0min,上清液作為空白試料,直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    取空白尿2ml,于3000r/min離心l0min,上清液1.0ml添加l00ug/L的克倫特羅對(duì)照溶液20/H。作為2ug/l空白添加試料,直接供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    ②試料的制備(肝)
    取約l00g新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機(jī)以10000r/rain勻漿1-2min,使均勻呈糊狀,一20~C以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/span>
    取均漿后的供試肝樣,作為供試試料。
    取均漿后的空白肝樣,作為空白試料。
    取均漿后的空白肝樣(1土0.05)e添加l00ng/m1的克倫特羅對(duì)照溶液20tzL作為2ng/g空白添加試料。
    a:提取(肝)  取(1士o.05)z試料,置50ml離心管中;加鹽酸溶液5.0mi,旋渦混勻,中速振蕩1.5h;在10—15~C下以4000r/mill以上速度離心15min;上清液移人另一50ml離心管中,加入氫氧化鈉溶液300gL,混勻,振蕩15min;加0.5mol/l磷酸二氫鉀溶液4。0ml,混勻,2—8~C放置過(guò)夜;取上述溶液于10~15~C以4000r/111113以上的速度離心15min,上清液備用。
    b.凈化(肝)  C,,固相萃取柱依次用無(wú)水甲醇3mi、0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液2mi預(yù)洗,不使柱床干涸;將備用上清液全部過(guò)柱;用0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗,擠干,棄去所有淋洗液;用無(wú)水甲醇2mi洗脫,流速控制在0.5ml/mm以下,擠干,收集洗脫液;于50~60~C下用氮?dú)饣蚩諝饩従彺蹈上疵撘?;殘余物用?.0ml溶解,以4000r/mill以上的速度離心15rain,清液作為試樣溶液供酶聯(lián)免疫測(cè)定法測(cè)定。
    ③測(cè)定
    a.室溫應(yīng)控制在19~30~C。
    b.取在19—30~C放置1—2h的試劑盒,按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計(jì)算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量,插入框架。每個(gè)微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL,封口膜封板,室溫孵育30min。
    c倒出孔內(nèi)液體,將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,使孔內(nèi)沒(méi)有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯(lián)板的微?L內(nèi),稍后倒出孔內(nèi)液體,再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,如此重復(fù)操作洗板3次。
    d.分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL,分別放入不同微孔底中央,并在每孔內(nèi)加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結(jié)合物100~I。,在微型振蕩器上混勻,用封口膜封好,室溫孵育30min。
    e.倒出孔內(nèi)液體,將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,使孔內(nèi)沒(méi)有殘余液體,重復(fù)洗板3次。
    f.用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL,室溫避光孵育15min。
    g.用多道移液器每孔加終止液100uL。
    h.在1h內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi),于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

http://syltech.b2b.hc360.com/

    (4)計(jì)算  用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得出試料中克倫特羅的含量。

    (5)靈敏度和回收率
    本方法的平均檢測(cè)下限為0.1mg/Kg。

    本方法在1ug/kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60%一120%,豬肝回收率范圍為40%~120%。

【公司名稱】 廣州健侖生物科技有限公司
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