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前列腺特異抗原(PSA)ELISA檢測試劑盒

發(fā)布時間:2015-12-28 15:28:23??????瀏覽次數:

背景簡介
  前列腺癌是中老年男性的常見多發(fā)病,在男性所有類型癌中占10%~20%, 是男性最常見的癌腫。測量血清中的前列腺特異抗原PSA可以用于篩選和早期診斷前列腺癌。它是公認的診斷前列腺癌的較好的腫瘤標志物,其診斷前列腺癌的特異性為82%-97%。前列腺特異抗原(prostate specific antigen , PSA) 是與前列腺癌相關的一種抗原,屬糖蛋白類物質。PSA和肛診是目前第一線家庭醫(yī)師或泌尿科醫(yī)師們篩檢早期前列腺癌的重要工具。 

試劑盒研制開發(fā)流程和結果: 
  1.PSA單克隆抗體的制備 
  最終篩選得到5株雜交瘤細胞株,分別測定其亞型,并通過競爭ELISA實驗進行表位分析。其中3株在之后的抗體配對實驗中驗證配對,其效價見下表。

Clone Ab Titer(OD450±SD) Ig subclass

S-44-10

2.350±0.079

IgG1,κ

S-102-11

20612±0.011

IgG2a, κ

S-191-5

2.332±0.081

IgG1,κ

  *The supernatant was from the culture of 1×106 hybridoma cells in 9 ml medium for 3 days.

  2.建立ELISA檢測試劑盒體系 
 ?。?)抗體配對分析 
  將獲得的5株單克隆抗體分別進行純化和標記,進行兩輛交叉配對試驗,最終篩選到兩組配對可用于雙抗體夾心法的ELISA試劑盒:S-44-10 (A) — S-191-5 (D)- HRP,S-102-11(B) — S-191-5(D)- HRP。 分別用于檢測總PSA (tPSA)和 游離PSA ( fPSA)。 
  如下圖所示(A:S-44-10抗體 B:S-102-11抗體 D:S-191-5抗體) 

 ?。?)兩種試劑盒的檢測標準曲線的建立(雙單抗夾心法) 
  經摸索優(yōu)化試劑盒中各種成分,最終選定了相應的原料使用濃度、試劑配方和反應條件。如圖所示:此兩種試劑盒檢測標準品均具有很好的線性關系。 

  (3) 試劑盒標準品 
  標定是測定的基礎,利用 NIBSC國際標準品對fPSA和tPSA試劑盒進行標定。 
  NIBSC國際標準品:

  • a. Prostate Specific Antigen (90:10) 96/670 (WHO International Standard or Reference Reagent);
  • b. Prostate Specific Antigen (free) 96/668 (WHO International Standard or Reference Reagent);

    本公司利用基因工程技術,在昆蟲真核系統(tǒng)中通過昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)表達并純化了重組的PSA,重組PSA用NIBSC標準品標定后,可以作為兩種試劑盒中的參照品使用。重組PSA作為試劑盒標準品的鑒定,如下圖所示。 

  (4)小樣本臨床實驗 
  將自行研制的試劑盒測定PSA臨床樣本(27份陽性+30份陰性), 以瑞典CanAg公司的試劑盒作為比較參照。

   

自制試劑盒

 
   

癌癥

非癌癥

合計

Canag試劑盒

癌癥

a

b

C

非癌癥

c

d

D

合計

A

B

H

其中:靈敏度 = a / C , 特異度 = d / D , 準確率= (a + d)/ H

   30份臨床陰性血清T-PSA兩種試劑盒測定結果對比圖 
 
  27份臨床陽性血清T-PSA兩種試劑盒測定結果對比圖 

 
  30份臨床陰性血清F-PSA兩種試劑盒測定結果對比圖 
 
  27份臨床陽性血清F-PSA兩種試劑盒測定結果對比圖 
 
  診斷標準:小樣本臨床試驗設定的前列腺癌本試劑盒診斷標準為:
  1)當tPSA > 10 ng/ml 判為陽性; 
  2) 當tPSA 處于灰區(qū)2.5 -10 ng/ml時, 則采用fPSA/tPSA < 0.25 判為陽性。 
臨床血清檢測結果



自制試劑盒




癌癥

非癌癥

合計

Canag試劑盒

癌癥

24

1

25

非癌癥

0

32

32

合計

24

33

57

由此得到的數據為:靈敏度 = 24 / 25 x 100% = 96.0% ,
特異度 = 32 / 32 x 100% = 100% ,
準確率= ( 24 + 32 )/ 57 x 100% = 98.2%

  (5)PSA試劑盒特性測定 
  線形范圍、靈敏度:

線形范圍0.5-50ng/ml,靈敏度0.5ng/ml

  試劑盒準確度: 

對于已知標準品濃度其測定的準確度為94.05%

  試劑盒特異性: 

與其他 疾病病人血清無交叉反應,特異性為100%

  試劑盒變異度: 
  10ng/ml的樣本,測量8次,批內變異度CV = 8.00%, 符合 CV < 15% 的要求。


取得成果 
  已研發(fā)出分別針對血清中游離PSA(f-PSA)以及總PSA(t-PSA)的檢測試劑盒,首次建立了“一步法”快速反應操作體系與流程,將整個操作過程時間縮短到了一小時以內。建立和優(yōu)化了夾心ELISA法檢測體系,包括試劑盒各組分的確定,各組分配方、使用條件及參數的優(yōu)化,檢測標準曲線的建立以及診斷標準的確定等。用NIBSC國際標準品對f-PSA及t-PSA兩種檢測試劑盒進行了標定,并通過基因工程手段自制了重組PSA蛋白,用國際標準品標定后,可用于兩種試劑盒參照品。 
  F-PSA試劑盒靈敏度為0.46ng/ml,準確度為94.1%,特異性為100%,批內變異度為8%;T-PSA試劑盒靈敏度為0.50ng/ml,準確度為94.1%,特異性為100%,批內變異度為8%。 
  小樣本臨床試驗證實本試劑盒與 Canag產品性能相似,57例樣本檢測的診斷結果對比顯示靈敏度 = 24 / 25 x 100% = 96.0% ,特異度 = 32 / 32 x 100% = 100% ,準確率= ( 24 + 32 )/ 57 x 100% = 98.2%。 

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